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GGGGCC反復配列の翻訳

全リーディングフレームにおけるGGGGCC反復配列の翻訳は、3つのDPRタンパク質(ポリグリシン[Gly]-ポリアラニン[Ala]、ポリグリシン-ポリプロリン[Pro]、ポリグリシン-ポリアルギニン[Arg])の生成をもたらすと考えられる。ポリGAとポリGPのタンパク質は疎水性が高いため、細胞内で凝集体を形成することがある。我々はマルトース結合タンパク質と融合した(GA)15および(GP)15ペプチドに対して抗体(抗GAと抗GP)を使用し、(GR)6反復配列を有するEBNA2Aエピトープに結合したモノクローナル抗体(抗GR)を分析した(19)。アフィニティー精製された3つの全DPR抗体が、他の2つのDRPタンパク質と交差反応せずに、免疫ブロット法でそれぞれの抗原に結合した(図1A)。

 

このような反復タンパク質が開始コドンの非存在下でも翻訳されるのかを調査するため、我々はC9orf72の反復領域部を複製し、それを哺乳類発現ベクターに導入した。GC含量が高いとシークエンシングが不可能であることから、反復回数が28~145の場合には(酵素による)制限消化しか利用できなかった(図1B)。GGGGCC反復配列の上流域にはATG開始コドンがほとんどなく、4~5つの停止コドンがあり、その数はリーディングフレームに左右される。これらの構造体をヒト胎児(HEK)293細胞に導入すると、38反復以上から増大し始めるタンパク質に抗GAが結合したため、反復配列が延長すると翻訳機構が効率的になる可能性が明らかとなった(図.1B)。我々はポリGR生成物を検出せず、145以下の反復が有する最長の構築体のみが検出可能な量のポリGPを発現した(図.1B)。

 

 

 

我々はポリGA凝集を分析するため、病原性C9orf72 6塩基反復配列伸長の有無に関係なく、FTLD/ALS-TDP患者と健常な対照群の死後のヒト小脳から得た2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)抽出物を用いてフィルタートラップアッセイ(20)を行った。そして、6塩基反復配列伸長を呈するFTLD/ALS患者のみで、ポリGAの強いシグナルを確認したため(図.1C)、ポリGAは小脳でSDS不溶性凝集体を形成することが明らかとなった。また、C9orf72患者で不溶性ポリGPおよびポリGRを検出した(図.1C)。2%SDS不溶性物質は、8%SDS沸騰液で部分的に可溶化したため、免疫ブロット法での分析が可能であった。また、3つの全リーディングフレームにおける高分子量のDPR凝集体がゲルの上端で検出され、これはとくにC9orf72変異を呈する患者で顕著であった(図.1D)。

 

 

Translation of the GGGGCC repeat in all reading
frames would result in three DPR proteins:
poly-(Gly-Ala), poly-(Gly-Pro), and poly-(Gly-
Arg). poly-GA and poly-GP proteins are extremely
hydrophobic and may form intracellular
aggregates. We raised antibodies (anti-GA and
anti-GP) against (GA)15 and (GP)15 peptides fused
to maltose binding protein and tested a monoclonal
antibody (anti-GR) that was originally
raised against an EBNA2A epitope with a (GR)6
repeat (19). All three affinity-purified DPR antibodies
detected the respective repeat antigen by
immunoblotting without cross-reaction with the
other two DPR proteins (Fig. 1A).
To investigate whether such repeat proteins
can be translated in the absence of a start codon,
we cloned parts of the repeat region from C9orf72
patients into a mammalian expression vector. For
the longer constructs, we could only use restriction
digest to estimate the repeat number ranging
from ~28 to ~145 (Fig. 1B), because the extreme
GC content precludes sequencing. The region upstream
of the GGGGCC repeat lacks ATG start
codons and contains four to five stop codons,
depending on the reading frame. Upon transfection
of these constructs into human embryonic
kidney (HEK) 293 cells, anti-GA detected proteins
of increasing size starting with a faint product
from ~38 repeats, suggesting that the translation
mechanism becomes more efficient with increasing
repeat length (Fig. 1B). We did not detect
poly-GR products, and only the longest construct
with ~145 repeats additionally expressed detectable
amounts of poly-GP (Fig. 1B).
To analyze poly-GA aggregation, we performed
filter trap assays (20) using 2% sodium dodecyl sulfate
(SDS) extracts from human postmortem cerebellum
of healthy controls and FTLD/ALS-TDP
patients with and without pathological C9orf72
hexanucleotide repeat expansion. We observed
strong poly-GA signal only in FTLD/ALS patient
with hexanucleotide repeat expansion (Fig. 1C),
indicating that poly-GA forms SDS-insoluble aggregates
in the cerebellum. We also detected insoluble
poly-GP and poly-GR in C9orf72 patients
(Fig. 1C). The 2% SDS-insoluble material was
partially solubilized upon boiling in 8% SDS and
could be analyzed by immunoblotting.We detected
high-molecular weight DPR aggregates in all three
reading frames at the top of the gel specifically
in patients with C9orf72 mutation (Fig. 1D).
mRNA expression of the mutant C9orf72 allele
is reported to be repressed through impaired
transcription or splicing (4, 6, 7). We also found
reduced C9orf72 mRNA levels in patient cerebellum
(fig. S1B). However, both sense and
antisense transcripts containing intron 1 (where
the GGGGCC repeat is located) were strongly increased
in C9orf72 patients (fig. S1C). This suggests
a selective stabilization of repeat containing
pre-mRNA (or the excised intron 1 alone) and
raises the possibility that the antisense strand may
be translated into poly-(Pro-Arg), poly-(Ala-Pro)
and further poly-GP DPR proteins.